Fundação para a Ciência e a Tecnologia
O óxido nítrico (NO) é uma importante molécula sinalizadora, que desempenha funções chave em vários processos (pato)fisiológicos, tais como a regulação do sistema vasodilatador e a pressão arterial, cito proteção após insulto isquémico, e infeção. A produção endógena de NO depende da actividade de uma família de enzimas, as sintases do óxido nítrico (NOS), as quais catalizam a oxidação da L-arginina em L-citrulina e NO, na presença de O2. O tempo de vida do NO é muito curto, sendo rapidamente oxidado nos seus metabolitos estáveis nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-). Perturbações na atividade das NOS podem causar insuficiência em NO, trazendo complicações para a saúde vascular. Vários trabalhos mostraram que em condições de hipóxia e acidose, o NO pode ser produzido alternativamente, através da redução do nitrito por parte de várias proteínas, enzimas, e sistemas não-enzimáticos, compensando assim a via L-arginina-oxigénio-NOS no controlo da pressão sanguínea. O nitrato também pode mediar estas transformações via a sua conversão em nitrito por acção de bactérias comensais presentes na boca, ligando assim a microflora oral ao controlo da pressão sanguínea. Como tal, o papel do nitrato do nitrito na fisiologia humana assume hoje uma grande relevância, colocando-os na linha da frente da biologia do NO. A biodisponibilidade do NO na cavidade oral é afetada por condições inflamatórias, como as doenças periodontais, as quais são desencadeadas por bactérias orais e envolvem a inflamação crónica das gengivas e tecidos em redor dos dentes, afectando cerca de 50% da população mundial. A resposta imune a vários taxons associados à periodontite liberta NO para limitar a inflamação e o acúmulo de placa. Como resultado, os níveis de nitrito/nitrato estão aumentados na saliva de pacientes com periodontite, destacando o papel do microbioma hospedeiro na proteção da gengiva na periodontite. Recentemente, foi demonstrado que as bactérias orais também podem reduzir o nitrito a amónia; contudo, a relevância dessa actividade ainda é desconhecida. Por conseguinte, existe uma interação intrincada entre todos os componentes do ciclo do azoto na saúde humana, e em algumas das doenças não transmissíveis mais prevalentes, como a hipertensão e a periodontite. Essas interacções e transformações devem ser mais bem descritas para que possa traduzir os resultados experimentais em informação clinicamente útil. No entanto, têm sido difíceis de medir os níveis circulantes destes iões em humanos porque os ensaios analíticos não fornecem selectividade e sensibilidade suficientes para detectar concentrações nM em amostras complexas. Além disso, essas metodologias não permitem o processamento rápido das amostras, não preservando os níveis originais das espécies de NOx. Assim, a pesquisa em biomedicina precisa com urgência de ferramentas para a quantificação rápida e fiável dessas espécies em amostras fisiológicas. Neste contexto, este projeto propõe-se a estabelecer um novo teste rápido (POCT), que seja de baixo custo e fácil de usar para quantificação de nitrato/nitrito/amónia em amostras fisiológicas, o N-Probe. Esta ferramenta basear-se-á em plataformas inovadoras para multi-análise, usando a moderna tecnologia de biossensores electroquímicos, nas quais a PI tem uma sólida experiência. Na prática, desenvolveremos biossensores para nitrato/nitrito, usando as enzimas redutoras de nitrato e nitrito, NapA e NrfA, respectivamente, as quais são altamente selectivas (produzidas no nosso lab.), enquanto que para a detecção de amónia, usaremos a enzima glutamato desidrogenase (disponível comercialmente). O N-Probe servirá de base para um estudo clínico transversal, a fim de avaliar possíveis associações entre hipertensão, periodontite e microbiota oral, por intermédio da bioquímica dos óxidos de azoto. Resumidamente, o estudo medirá in situ os 3 diferentes metabolitos, nitrato, nitrito e amónia, em amostras de saliva e plasma (sem pré-prearação), ao mesmo tempo que analisará outros parâmetros clínicos que são cruciais para entender as possíveis ligações entre CVDs e saúde oral (hipertensão, microflora). Para executar este ambicioso estudo, reunimos uma equipa de especialistas com o know-how em áreas técnicas/científicas requeridas para a realização do projecto, a saber, biotecnologia (produção de enzimas), eng. biomédica (tecnologia de biossensores), análises clínicas (amostragem de fluidos fisiológicos), saúde oral (periodontologia e microbiologia), bioestatística e biomedicina (fisiologia do NOx). A integração dessas competências complementares com instalações de excelência (EM Dental Clinic, UCIBIO, CiiEM) é muito poderosa e permitirá a implementação de ferramentas inovadoras nunca antes testadas em ambientes clínicos, e realizar o maior estudo clínico sobre o metabolismo oral do azoto.
